低溫狀態(tài)，細(xì)胞能否存儲，保持活性，有一個避不開的話題：冰晶。我們技術(shù)團(tuán)隊很榮幸有機(jī)會聆聽清華大學(xué)曹海山副教授的研究團(tuán)隊對于細(xì)胞低溫保存玻璃化技術(shù)的講座。

使用玻璃化技術(shù)的生物材料存活率會更高。在將生物材料冷卻時，經(jīng)常使用冷凍保護(hù)劑（CPA）。

為了更好地理解玻璃化和結(jié)晶過程，清華大學(xué)曹海山副教授的研究團(tuán)隊通過使用高速顯微鏡、相機(jī)和拉曼光譜儀，報告了用不同濃度的二甲基亞砜（DMSO）溶液冷凍保護(hù)的洋蔥表皮細(xì)胞的結(jié)晶和玻璃化的動態(tài)過程。

在實驗中使用的低溫顯微鏡系統(tǒng)主要包括一個生物顯微鏡，配備了一個冷卻臺和一個高速相機(jī)。冷卻臺的溫度由Linkam控制器調(diào)節(jié)，從-196℃到100℃，精確度為0.01℃。冷卻或升溫的速度可以在0.01℃/min到130℃/min的范圍內(nèi)控制。

研究者用低溫顯微鏡觀察到了冷卻過程中細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外液的五種結(jié)晶和玻璃化現(xiàn)象。

在冷卻速度為10℃/min至130℃/min的情況下，0-30%DMSO溶液中的細(xì)胞都會結(jié)晶。對于浸泡在0-20%DMSO溶液中的細(xì)胞，冰晶首先在觀察區(qū)外的細(xì)胞外空間形成核。冰晶的生長和傳播到觀察區(qū)，直到該區(qū)結(jié)晶，對于浸泡在30%DMSO溶液中的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)冰晶的傳播先于細(xì)胞外冰晶的傳播（圖1A-1B）。

圖1A-1B

單個細(xì)胞中胞內(nèi)冰晶的形成有三種模式（圖1C），模式一，冰晶的生長從細(xì)胞一側(cè)的成核點開始，然后向細(xì)胞內(nèi)傳播。模式II，冰晶的生長從細(xì)胞兩邊的兩個成核點開始，然后傳播到細(xì)胞的中心。模式III，冰晶的生長從細(xì)胞內(nèi)的一個成核點開始，然后傳播到細(xì)胞的邊界。

圖1C

細(xì)胞外結(jié)晶和細(xì)胞內(nèi)玻璃化 

以130℃/min的冷卻速度，浸泡在40%DMSO溶液中的細(xì)胞冷卻到-140℃，細(xì)胞內(nèi)的液體被玻璃化。然而，非晶相不是純粹的玻璃狀固體，而是嵌入玻璃狀基質(zhì)的納米/微晶域（圖3）。

細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的玻璃化作用  

在冷卻速度為1℃/min的冷卻過程中，浸泡在50-70%DMSO溶液中的細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外液都轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂屑{米/微晶域的玻璃基質(zhì)（圖4A）。隨著溫度從-50℃降到-140℃，浸泡在50%DMSO溶液中的細(xì)胞，納米/微晶域的晶體面積分?jǐn)?shù)從0%增加到6.6%（圖4B）。當(dāng)細(xì)胞從室溫冷卻到-140℃時，晶體面積分?jǐn)?shù)從高到低依次是浸泡在50%、70%和60%DMSO溶液中的細(xì)胞。因此，并不是DMSO濃度越高，低溫保存就越有效。

當(dāng)細(xì)胞從室溫冷卻到-140℃時，隨著冷卻速率的增加，晶體面積分?jǐn)?shù)下降（圖4C）。

上海京燦，雖然在細(xì)胞領(lǐng)域研究并不深入，但我們?yōu)榭蛻籼峁┖糜玫囊旱蓿ＷC研究過程中溫度穩(wěn)定，運輸過程中，也能保證溫度控制，無論是進(jìn)口杜瓦瓶，還是自增壓液氮罐，我們經(jīng)驗豐富，貨期短，價格美。